Методы оценки функционирования вставки

5.5. Методы оценки функционирования вставки

5.5.1. Определение мРНК, продуцируемой вставкой, которая введена в геном растения с помощью гнездовой ПЦР.

Выделение препаратов суммарной мРНК из образцов продукта гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом [125] и проведение последующих гнездовых ПЦР с декларированными праймерами [126, 125]. Детектирование синтезированных кДНК электрофорезом в полиакриламидном геле с окрашиванием этидиум бромидом [126].

5.5.2. Двумерный электрофоретический анализ белков.

В работе используются следующие реактивы: акриламид, метилен-бисакриламид, агароза, трис, глицин, додецилсульфат натрия, персульфат аммония, тритон Х-100, дитиотриэтол, Амберлит МВ-1, 2-меркаптоэтанол, кумасси бриллиантовый голубой R-250, кумасси бриллиантовый голубой G-250, Tween-20, 4-хлор-1-нафтол, бычий сывороточный альбумин - фирмы «Serva» (Германия); ТВИН-20 - фирмы «Merk» (Германия) амфолины рН 3 - 10, рН 5 - 7, рН 5 - 8, фирмы «LKB» (Швеция).

В качестве расходных материалов применяются также: нитроцеллюлозные фильтры - фирмы «Schleicher and Schull» (Германия).

Белковые экстракты из всех изучающихся биологических материалов готовят сходным образом, используя для обеспечения максимальной солюбилизации белков лизирующий раствор (ЛР), с высоким содержанием денатурирующих агентов - мочевины, меркаптоэтанола (дитиотриэтола), и тритона Х-100. ЛР - раствор 9 М мочевины, содержащий 5 % 2-меркаптоэтанола, 2 % тритон Х-100, 2 % амфолины 3,5-10.

При приготовлении ЛР сначала мочевину растворяют в деионизованной воде и дополнительно очищают добавлением Амберлит МВ-1. После 10 мин инкубации амберлит отделяют, и к раствору мочевины добавляют Тритон Х-100, дитиотриэтол (или 2-меркаптоэтанол), амфолины рН 3 - 10 до указанных концентраций.

При экстракции белков образцы тканей измельчают ножницами и несколько раз промывают холодным физиологическим раствором. Затем измельченную ткань гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в ЛР в соотношении 100 мг ткани на 2 мл ЛР и центрифугируют при 700g в течение 10 мин. Надосадочную фракцию, содержащую солюбилизированные белки (экстракт), используют для дальнейшей работы.

Для анализа белков используют двумерный электрофорез по О'Фарреллу - метод, сочетающий фракционирование белков изоэлектрофокусированием (первое направление) с гель-электрофорезом в присутствии SDS [128, 129].

Изоэлектрофокусирование проводят в стеклянных трубках длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,5 мм. Трубки устанавливают в штатив, герметизируют нижние отверстия пленкой Parafilm и заливают полимеризационной смесью. Для составления полимеризационной смеси готовят следующие реактивы:

1.1. 30 %-ный акриламид, 1,6 % метиленбисакриламид;

1.2. 20 %-ный тритон Х-100;

1.3. 10 %-ный персульфат аммония;

1.4. Анодный буфер для изоэлектрофокусирования: 0,01 М фосфорная кислота;

1.5. Катодный буфер для изоэлектрофокусирования: 0,02 М NaOH;

1.6. Защитный раствор: 4,5 М раствор мочевины, содержащий 1 % Тритона Х-100; 2,5 % меркаптоэтанола, 1 % амфолинов рН 3,5 - 10.

1.7. Переводный буфер для геля первого направления - белковый буфер (см. п. 2.2.).

Растворы 1.1; 1.2; 1.6; 1.7 хранят при температуре 4 °С в течение 2 - 3 недель. Остальные используют свежеприготовленными.

Приготовление 20 мл полимеризационной смеси, необходимой для заполнения 12 трубок, осуществляют, смешивая 12 г мочевины, 6,75 мл дистиллированной воды, 3 мл раствора 1.1, 2,25 мл раствора Тритона Х-100 (20 %). Эту смесь обрабатывают ионообменной смолой амберлит МБ-1, отфильтровывают и добавляют к ней 225 мкл амфолинов рН 3,5 - 10 и 900 мкл амфолинов рН 5 - 7. Смесь дегазируют, а непосредственно перед заливкой в трубки к ней добавляют 22,5 мкл ТЕМЕД и 32,5 мкл 10 %-ного раствора ПСА.

Полимеризационную смесь в трубки вносят шприцем, заполняя трубки снизу вверх до одного уровня - на 2 - 3 см ниже верхнего края (высота колонки геля 11 см). Сверху наслаивают воду.

После окончания полимеризации геля воду над его поверхностью удаляют и трубки устанавливают в гельэлектрофоретическую камеру «Bio-Red», модель 175 (США). В нижний резервуар камеры наливают раствор катодный буфер. В трубки наносят анализируемые образцы, в объеме 50 - 150 мкл (100 мкг белка). В полупрепаративном варианте фракционирования объем наносимого образца увеличивают до 250 - 350 мкл. Сверху, по краям трубки, наслаивают защитный раствор 1.7 и верхнюю камеру прибора заполняют анодным буфером.

Изоэлектрофокусирование до равновесного состояния проводят при напряжении, начиная с 400 В до 200 В×ч, и затем при напряжении 1000 В до суммарного значения 5400 В×ч, или (ночной режим), при напряжении 210 В двадцать часов и затем один час 1000 В до того же суммарного значения 5400 В×ч. Неравновесный вариант изоэлектрофокусирования проводят при напряжении, начиная с 400 В до 200 В×ч, и затем при напряжении 1000 В×ч до суммарного значения 1000 - 2500 В×ч.

По окончании изоэлектрофокусирования колонки геля вымачивают в 5 мл переводного буфера (раствор 1.7) 10 мин при комнатной температуре. Затем гели, не предназначенные для немедленного фракционирования во втором направлении, быстро замораживают и хранят при температуре -20 °С до нескольких недель.

Для фракционирования во втором направлении используют модифицированный метод Леммли [130] в пластинах с градиентом ПААГ 7,5 - 25 % в присутствии SDS.

Для этой цели готовят следующие растворы, из которых затем составляют полимеризационные смеси для формирования пластин ПААГ:

2.1. 60 %-ный акриламид, 0,8 %-ный метиленбисакриламид;

2.2. Буфер для разделяющего геля: 1 М Трис-HCl (рН 8,8);

2.3. Буфер для концентрирующего геля: 0,5 М Трис-HCl (рН 6,8);

2.4. 10 %-ный додецилсульфат натрия;

2.5. 10 %-ный персульфат аммония;

2.6. Электродный буфер для электрофореза: 0,025 М Трис, 0,192 М глицин, 0,1 %-ный SDS (рН 8,3);

2.7. Агарозный гель: 1 % агароза в растворе 2.6 с добавлением 0,125 % бромфенолового синего. После приготовления раствор необходимо прокипятить в течение 5 мин, а перед каждым использованием гель необходимо растопить.

Раствор 2.5 готовят непосредственно перед употреблением, остальные хранят при температуре 4 °С.

Фракционирование во втором направлении осуществляют в пластинах ПААГ размером 160´160´1 мм с линейным градиентом концентрации акриламида 7,5 - 25 %, в приборе для вертикального электрофореза. Пластины геля готовят в стандартных стеклянных кассетах. Пример с подробным описанием использования этого оборудования опубликован ранее [131].

Обычно для параллельного формирования 6 гелевых пластин с градиентом концентрации акриламида (разделяющий гель) готовят 2 раствора: легкий (концентрация АА 7,5 %) и тяжелый (концентрация АА 25 %), по 100 мл каждого. Полный состав этих растворов приведен в таблице.

Таблица

Источник: МУК 2.3.2.970-00: Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников